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Latin American Journal of Clinical Sciences and Medical Tecnology
Monday April 19th, 2021
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Joshua Jarim Esqueda-Balcázar (0000-0002-4359-7017)a; María Estela Meléndez-Camargo (0000-0002-6052-0281)a.
aDepartamento de Farmacia, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional.
Autor para correspondencia: , . Números telefónicos: ; e-mail: mcamargo@ipn.mx, emelendezc@hotmail.com

Cita: Esqueda Balcázar JJ, Meléndez Camargo ME. Evaluación de la actividad diurética del extracto acuoso de Eryngium heterophyllum Engelm (hierba del sapo) en la rata.
Lat Am J Clin Sci Med Technol. 2021 Jan; 3: 7-14.
Recibido: November 22nd, 2020.
Aceptado: January 8th, 2021.
Publicado: January 19th, 2021.
Vistas: 1521
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RESUMEN

Tradicionalmente, Eryngium heterophyllum Engelm, conocida como hierba del sapo, se ha empleado en padecimientos renales. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad diurética del extracto acuoso en la rata. El material vegetal se recolectó, identificó y se llevó a cabo el estudio fitoquímico preliminar. Para la evaluación diurética se utilizaron ratas Wistar, hembras, adultas de 200 ± 20 g de peso corporal (p.c.). Se distribuyeron en cinco grupos: el vehículo, el grupo furosemida (4 mg/kg de p.c.) y el extracto acuoso a las dosis de 200, 400 y 800 mg/kg de p.c., per os. Después de seis horas en jaulas metabólicas, se obtuvieron muestras de orina y suero para determinar la concentración de sodio, potasio y creatinina. Se calcularon el flujo urinario y la depuración de creatinina, Na+ y K+, las excreciones y carga filtrada de los iones. Se determinó la DL50 en ratones NIH hembra, adultas de 25 ± 5 g de p.c., tratados con el extracto (1, 2, 4 y 8 g/kg de p.c.). Se usa como decocción y en el análisis fitoquímico se detectaron cumarinas, alcaloides, flavonoides, taninos y saponinas. Se observó incremento en el flujo urinario, en la excreción urinaria y depuración de iones en los grupos tratados con furosemida y a las diferentes dosis del extracto. La DL50 es mayor a 8 g/kg de p.c. Los resultados sugieren que Eryngium heterophyllum indujo actividad diurética por efecto tubular renal directo. El estudio de especies vegetales es importante para avalar el uso empírico de las mismas.

Palabras clave: furosemida, balance de agua y electrolitos, plantas medicinales, Eryngium
ABSTRACT

Eryngium heterophyllum Engelm, known as “toad grass”, has been traditionally used in renal diseases. The aim of the study was to evaluate the diuretic activity of the aqueous extract in the rat. The vegetal material was collected, identified, and the preliminary phytochemical study was carried out. For the diuretic evaluation, Wistar rats, female, adult of 200 ± 20 g of body weight (b.w.) were used, and they were distributed in five groups: the vehicle, the furosemide group (4 mg/kg of b.w.) and the aqueous extract at the doses of 200, 400 and 800 mg/kg of b.w., per os. After six hours in metabolic cages, urine and serum samples were obtained to measure the concentrations of sodium, potassium and creatinine. With these data, urine flow and creatinine, Na+ and K+ clearance, excretion and filtered ion load were calculated. LD50 in femal NIH mice, adults of 25 ± 5 g of b.w., treated with the extract (1, 2, 4 and 8 g/kg of b.w.) was determined. Decoction is used and the phytochemical study coumarins, alkaloids, flavonoids, tannins and saponins were detected. In the diuretic evaluation, an increase in the urinary flow, in the urinary excretion and ion clearance in the groups treated with furosemide and at different doses of the extract were observed. The LD50 is higher than 8 g/kg of b.w. Eryngium heterophyllum Engelm diuretic action was induced by direct renal tubular effect. The study of plant species is important to support their empirical use.

Keywords: furosemide, water electrolyte balance, medicinal plants, Eryngium

INTRODUCCIÓN

La medicina tradicional es reconocida como un recurso elemental para la salud; es una práctica curativa de la enfermedad entre las diversas culturas alrededor del mundo.1 Para las civilizaciones del México prehispánico y moderno, las plantas medicinales, generosas de sustancias curativas, siguen siendo un elemento fundamental de la vida cotidiana, ya que se utilizan como medicina alternativa.2

Eryngium heterophyllum Engelm, comúnmente conocida como “hierba del sapo”, es una planta perenne endémica de México que se desarrolla en zonas altas de pino-encino; se le puede encontrar fácilmente en sitios abiertos a orilla de parcelas y en superficies con abundante planta arvense. Posee inflorescencias compuestas de cabezuelas ovoides de color azul, violeta o blancas.3 Es una especie utilizada en la medicina popular, a la que empíricamente se le han atribuido diversas propiedades terapéuticas para el tratamiento de diabetes, hipercolesterolemia, padecimientos renales, entre otras.

El objetivo de este trabajo fue la evaluación de la actividad diurética del extracto acuoso de Eryngium heterophyllum (E. heterophyllum) en la rata. La decocción de la parte aérea de E. heterophyllum tiene un uso bastante popular en la medicina tradicional mexicana como remedio herbal para varias enfermedades del tracto renal, especialmente como agente diurético para el tratamiento de infecciones de riñón y vejiga en la comunidad Los Amoles, municipio de Moroleón, Guanajuato.

Informes publicados acerca de la hierba del sapo en la respuesta hipocolesterolémica reportan que el extracto acuoso a dosis de 100 mg/kg disminuyó el colesterol en 9%.4 También se ha evaluado la actividad tripanocida de E. heterophyllum y los resultados indican porcentajes de inhibición de crecimiento entre 88 y 100% de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi cultivados con los extractos metanólicos de la planta.5 A pesar de que se han evaluado otras plantas con efecto diurético como Selaginella lepidophylla6, Bidens odorata7 y Eysenhardtia polystachya8, E. heterophyllum Engelm presenta ventaja sobre éstas porque es una planta perenne y es de muy fácil acceso. Con todo, no había un estudio sistemático acerca de su principal uso etnofarmacológico como diurético, por lo que se consideró necesario llevarlo a cabo para verificar la eficacia y seguridad del extracto acuoso de E. heterophyllum Engelm en un modelo experimental de diuresis en rata.

MATERIAL Y MÉTODOS

Recolección del material vegetal

El material vegetal fue recolectado en el mes de julio de 2019 en la comunidad Los Amoles, perteneciente al municipio de Moroleón, Guanajuato. La identificación botánica y autentificación fue realizada por el M. en C Neil Abdiel Felipe Mendoza. Un ejemplar de prueba fue depositado en el herbario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional (ENCB) para futuras referencias.

Preparación del extracto acuoso

La parte aérea de la planta se secó al aire a temperatura ambiente; el extracto acuoso de E. heterophyllum se preparó en forma de decocción; se pesaron 5 g de material vegetal seco, se colocó en un vaso de precipitado y se agregó 50 mL de agua destilada que se llevó a ebullición (100 ºC) por 5 minutos y, posteriormente, se filtró con papel Whatman. El extracto fue preparado siempre justo antes de la administración a los animales prueba. Las dosis utilizadas fueron calculadas de acuerdo con una relación a dosis utilizada en humanos (1.42 g/kg de p.c., en decocción, como agua de uso).

Análisis fitoquímico preliminar

Para la identificación de los metabolitos secundarios, presentes en el extracto acuoso de E. heterophyllum, se llevaron a cabo reacciones de coloración y precipitación.9 Para la detección de alcaloides se utilizaron los reactivos de Dragendorrff, Mayer, Wagner, Sonnenschein y ácido silicotúngstico; para los flavonoides por el reactivo de Shinoda e hidróxido de sodio al 10%, las saponinas por reactivo de Rosenthaler, las cumarinas por reactivo de Erlich y los taninos por reactivo gelatina, cloruro férrico 1% y ferricianuro de potasio 1%. Los resultados de las pruebas se reportaron de acuerdo con una escala de intensidad o cambio en el color o presencia de precipitado. La intensidad se clasificó de la siguiente manera: abundante (+ + +), moderada ( + + ), baja (+) y ausente (- ).

Material biológico

Se utilizaron ratas Wistar, hembras adultas de 200 ± 20 g de peso corporal (p.c) y ratones NIH hembra de 25± 5 g de p.c. Fueron alojados en el bioterio por siete días para su acondicionamiento; se mantuvieron ahí a temperatura ambiente (22-24º C) y 50-55% de humedad relativa, con ciclos de luz/oscuridad 12 x 12 horas. Fueron alimentados con una dieta estándar para roedores y agua ad libitum. El cuidado y manejo de los animales se realizó de acuerdo con las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio (NOM-062-ZOO-1999).10 Este protocolo fue aprobado por el comité de Bioética para la investigación en animales experimentales de la ENCB.

Actividad diurética del extracto acuoso de E. heterophyllum

Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum sobre el flujo urinario

Los experimentos se llevaron a cabo en ratas no anestesiadas. Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos, el número de animales por grupo fue mínimo de 6. El grupo testigo recibió agua (vehículo, 1 µL/g de p.c.), el grupo tratado con furosemida (Lasix ®, 4 mg/kg) y tres grupos tratados con el extracto acuoso a las dosis de 200, 400 y 800 mg/kg, respectivamente. En todos los grupos la administración fue per os.

Al inicio del experimento se pesaron y marcaron los animales de experimentación, posteriormente se vació la vejiga urinaria mediante una suave compresión abdominal (t=0) como lo describe Meléndez y colaboradores7, posteriormente se administraron los tratamientos.

Los animales se mantuvieron durante seis horas en jaulas metabólicas en ambiente tranquilo y cálido, bajo privación de líquidos y alimentos. Al final de dicho período se obtuvo la muestra de orina (t=6), se realizó nuevamente una ligera compresión del abdomen para asegurar el completo vaciado de la vejiga y se recogió en pipetas calibradas; se midió el volumen de orina. Los animales fueron decapitados y se obtuvieron muestras de sangre que se centrifugaron a 3000 rpm, durante 10 minutos para separar las células sanguíneas del suero.

Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en el equilibrio electrolítico

Para estudiar el efecto del extracto acuoso, se midieron las concentraciones de sodio y potasio en muestras de orina y plasma (Flamómetro Corning 400, Corning Medical and Scientific, Inglaterra) de las ratas tratadas. Posteriormente, se calcularon las excreciones urinarias y las depuraciones de sodio y potasio.

Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en la velocidad de filtración glomerular

La velocidad de filtración glomerular (VFG) se estimó mediante la depuración de creatinina endógena. Para evitar el error debido a la secreción tubular de creatinina, sólo se utilizaron ratas hembras, que no secretan creatinina.11 La creatinina plasmática y urinaria se cuantificó mediante el método de picrato alcalino de Jaffe.12

La depuración de creatinina, excreción fraccionar y la excreción urinaria de sodio y potasio se calcularon utilizando las ecuaciones convencionales (1, 2 y 3):

1. CCreat= (UCreat * FU / SCreat)

Donde: CCreat es el aclaramiento de creatinina, UCreat concentración de creatinina en la orina, FU es el flujo urinario y SCreat concentración de creatinina en suero.

2. EFion = (Cion / Ccreat ) * 100

EFion es la excreción fraccional (%) del ion.

3. EUion = (FU) * (Uion)

Donde: EUion es la excreción de iones, FU es el flujo urinario y Uion es la concentración de iones en la orina.

Toxicidad aguda

Se realizó un estudio de toxicidad aguda en ratones NIH hembra de 25 ± 5 g de p.c. Se formaron aleatoriamente cinco grupos de cuatro animales cada uno13, un grupo testigo (vehículo) y el resto de grupos fueron administrados con el extracto acuoso de E. heterophyllum a dosis de 1, 2, 4 y 8 g/kg de p.c., per os. Los ratones fueron privados de alimento 18 horas antes de iniciar el estudio y sólo se mantuvieron con agua ad libitum. Los animales estuvieron bajo observación durante las primeras tres horas después de la administración y durante siete días posteriores. Se contabilizaron animales vivos y muertos, así como cualquier signo de toxicidad.

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como medias ± error estándar. Para realizar los análisis estadísticos se utilizó el software GraphPad Prism® 8.0. Los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA). Para las comparaciones post-hoc se utilizó la prueba estadística de Bonferroni. Se consideró una P < 0.05 como significativa con respecto al grupo testigo.

RESULTADOS

Se entrevistó a 20 personas, la mayoría de ellas sabía de plantas medicinales porque los conocimientos herbolarios les fueron transmitidos de sus padres. La edad promedio de los informantes clave fue de 60 años. Se identificaron más de diez especies medicinales con diferentes usos.

Las nefropatías fueron los padecimientos más tratados con la medicina tradicional. Al término de las entrevistas se encontró que la hierba del sapo es la más empleada para tratar afecciones como hipercolesterolemia, hiperglucemia, mal de orín (infecciones de vías urinarias) y diurético.

E. heterophyllum se prepara por decocción de un puño de la parte aérea de la planta en un litro de agua y se consume como agua de uso hasta que desaparezcan los síntomas.

El análisis fitoquímico preliminar, con métodos mencionados en Domínguez9 , reveló la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas y cumarinas (Tabla 1).

Tabla 1. Análisis fitoquímico preliminar de Eryngium heterophyllum
MetabolitoPruebaExtracto acuoso
Intensidad
AlcaloidesMayer+ +

Dragendorff+ + +

Ácido silicotúngstico+ + +

Sonnenschein+ + +

Wagner+ +

Saponinas (triterpenoides)Rosenthaler+

CumarinasErlich+ +

Flavonoides (flavonas y xantonas)Shinoda+ + +

Hidróxido de sodio 10 %+ + +

QuinonasHidróxido de amonio-

Ácido sulfúrico concentrado-

Börntraguer-

Glucósidos cardiotónicosLegal-

Baljet-

Glucósidos cianogenéticosGignard-

Taninos
(derivados catecólicos y compuestos fenólicos)
Gelatina+ +

Cloruro férrico 1 %+ + +

Ferricianuro de potasio 1 %+ + +

Intensidad: abundante (+ + +), moderada (+ +), baja (+) y ausente (-)

Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum sobre el flujo urinario

Se observó aumento en el flujo urinario en los grupos tratados con el extracto acuoso y en el grupo tratado con furosemida, pero sólo las dosis de 200 y 400 mg/kg fueron estadísticamente diferentes respecto al grupo testigo (Figura 1, P<0.05).

Se presentan la media ± el error estándar, (**P<0.01; *P<0.05 con respecto al grupo testigo) n=6

Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en el equilibrio electrolítico

La excreción urinaria (EU) de sodio aumentó en los grupos tratados con el extracto acuoso y furosemida (P<0.01), pero únicamente los grupos tratados con las dosis de 200 y 400 mg/kg produjeron aumento significativo (P<0.05) con respecto al grupo testigo (Figura 2A). La EU de potasio incrementó en la dosis de 200mg/kg (P<0.05) (Figura 2B).

Se presentan las medias ± el error estándar (**P<0.01; *P<0.05 con respecto al grupo testigo) n=6

Los valores séricos de sodio y potasio no se modificaron en ninguno de los grupos estudiados (datos no mostrados). La depuración de sodio aumentó (P<0.05) en los grupos tratados con el extracto a las dosis de 200 y 400 mg/kg y furosemida con respecto al grupo testigo. El extracto acuoso indujo aumento significativo en la depuración de potasio en los tres grupos tratados con el extracto similar a la furosemida (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en la depuracion de creatinina, sodio y potasio
GrupoCCreat (μL / min)CNa+ (μL / min)CK+ (μL / min)
Testigo1.04 ± 0.065.21± 0.65195.08 ± 10.69

Furosemida 4 mg / kg1.02 ± 0.0323.25 ± 2.71* *406.79 ± 20.52*

E. heterophyllum 200 mg / kg1.02 ± 0.0415.03 ± 1.70*359.13 ± 28.97*

E. heterophyllum 400 mg / kg0.99 ± 0.9917.82 ± 2.53*369.12 ± 51.30*

E. heterophyllum 800 mg / kg1.04 ± 0.0413.15 ± 1.46335.79 ± 24.22*

Se presenta la media ± el error estándar, (**P<0.01; *P<0.05 con respecto al grupo testigo) n=6
Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en la velocidad de filtración glomerular y las cargas filtradas de sodio y potasio

La depuración de creatinina no se modifica en ninguno de los grupos tratados, por lo que no se alteró la velocidad de filtración glomerular (VFG) (Tabla 2). Tampoco se modificó la carga filtrada (CF) de sodio y potasio en ninguno de los grupos (datos no mostrados).

Excreción fraccional de sodio y potasio

La excreción fraccional (EF) de sodio incrementó en el grupo tratado con furosemida y en los grupos tratados con el extracto acuoso, con respecto al grupo testigo (P<0.05). La EF de potasio en los grupos tratados con furosemida y con el extracto acuoso de E. heterophyllum a las tres dosis utilizadas incrementó, pero sólo los grupos furosemida y tratados con el extracto a las dosis de 200 y 400 mg/kg alcanzaron significancia estadística (P<0.05) con respecto al testigo (Tabla 3).

Tabla 2. Efecto del extracto acuoso de E. heterophyllum en la excreción fraccional de sodio y potasio
GrupoEFNa+ (%)EFK+ (%)
Testigo0.53 ± 0.0720.05 ± 1.77

Furosemida 4 mg / kg2.17 ± 0.33*36.12 ± 3.06*

E. heterophyllum 200 mg / kg1.47 ± 0.14*35.38 ± 2.85*

E. heterophyllum 400 mg / kg1.83 ± 0.28*37.52 ± 5.52*

E. heterophyllum 800 mg / kg1.26 ± 0.14*32.27 ± 2.47

Se presenta la media ± el error estándar, (*P<0.05 con respecto al grupo testigo) n=6
Toxicidad aguda

Ninguna de las dosis del extracto acuoso produjo mortalidad ni alteraciones del comportamiento; por tanto, la DL50 es mayor a 8 g/kg de p.c.

DISCUSIÓN

Se sabe que algunas especies vegetales han sido evaluadas por su actividad diurética6, 8, 14, 15 y que producen poca toxicidad en comparación con fármacos diuréticos que se emplean hoy en día con fines terapéuticos.

Debido a que Eryngium heterophyllum Engelm se emplea en la medicina tradicional por sus efectos diuréticos fue importante evaluar de manera experimental su efectividad farmacológica.

El análisis fitoquímico preliminar de esta planta mostró que los principales metabolitos son alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos y saponinas, los cuales son reportados en este género.16

Los diuréticos aumentan el flujo de orina y la excreción de sodio, razón por la que se utilizan para ajustar el volumen y/o la composición de los fluidos corporales en condiciones clínicas como insuficiencia cardíaca, hipertensión, síndrome nefrótico, entre otras. Los diuréticos de asa (como furosemida) pueden incrementar el flujo urinario y son fuertemente saluréticos en la medida que aumentan la excreción urinaria de sodio y cloro17, por lo que en este estudio se utilizó furosemida como fármaco de referencia a 4 mg/kg de p.c. debido a que esta dosis induce un efecto en el balance electrolítico y excreción de agua, sin modificarse la VFG.12

Con este trabajo se demostró la actividad diurética del extracto acuoso de E. heterophyllum, como se describe en la Medicina Tradicional, para el tratamiento de enfermedades renales y del tracto urinario. Los presentes resultados revelan que E. heterophyllum (200 y 400 mg/kg) indujo una importante acción diurética debido a que se mostraron incrementos en el flujo urinario y en la excreción urinaria de sodio, similares a la furosemida. Este efecto sobre la excreción urinaria de sodio es proporcional a la capacidad de la planta para excretar agua, lo que sugiere que el efecto diurético de E. heterophyllum es de tipo salurético.

El extracto acuoso a 200 y 400 mg/kg indujo incremento en la depuración de sodio, similar al grupo tratado con furosemida. El aumento significativo en la excreción fraccional de sodio a las tres dosis evaluadas, aunado a que la VFG no se modificó en los grupos tratados con el extracto, sugieren que el extracto acuoso induce acción diurética por efecto tubular renal directo.7,18 Sin embargo, el mecanismo de acción de E. heterophyllum no puede dilucidarse porque es un extracto con una mezcla de compuestos que pueden estar trabajando individualmente o en sinergia.

Los resultados del análisis fitoquímico sugieren que las saponinas, flavonoides y alcaloides, metabolitos secundarios (encontrados en el extracto acuoso de E. heterophyllum) pueden estar involucrados en el efecto diurético inducido por esta especie, resultados obtenidos en otras investigaciones.6, 8, 19

Se sabe que las saponinas triterpénicas de las raíces de Ampelozizyphus amazonicus Ducke aumentan el flujo de orina en rata.19 También que el extracto acuoso y la fracción rica de alcaloides de Selaginella lepidophylla inducen una respuesta diurética en rata.6 En otra evaluación diurética se detectaron saponinas, taninos, cumarinas y flavonoides en la corteza de Eysenhardtia polystachya por lo que se les responsabiliza del efecto diurético observado.8 Será interesante realizar estudios moleculares para indagar la vía de señalización en el mecanismo de acción de estos compuestos sobre sus receptores.

Se sabe que los flavonoides tienen efecto en los receptores de Adenosina A1, lo cual induce la diuresis y la excreción de sodio mediante la inhibición de la reabsorción de sodio en los túbulos proximales o indirectamente al promover la dilatación de las arteriolas aferentes.20 Además, se ha demostrado que KW-3902 (Rolofilina), un antagonista del receptor de Adenosina A1, desempeña un papel potencial como complemento de los diuréticos de asa para mejorar la diuresis y reducir la cantidad de fármaco necesaria en la farmacoterapia al prevenir el deterioro de la función renal durante el tratamiento en pacientes con insuficiencia cardíaca descompensada aguda, insuficiencia renal y resistencia diurética.21

Cabe mencionar que esta planta no presentó efectos tóxicos a las dosis evaluadas, por lo que se puede considerar que la administración del extracto acuoso de E. heterophyllum a las dosis usadas por la comunidad no es tóxica.

El propósito de este estudio es incrementar los conocimientos científicos acerca del uso terapéutico de las plantas medicinales que forman parte de la etnobotánica. En estudios futuros se busca identificar los metabolitos presentes y si actúan de forma individual o sinérgica. Los resultados obtenidos son importantes porque permiten conocer que la especie investigada tiene un efecto farmacológico y que su uso es seguro porque las personas de la comunidad la han utilizado desde tiempo atrás. Finalmente, también se amplía el acervo de las plantas estudiadas en nuestro país con efecto medicinal.

CONCLUSIONES

Estos resultados muestran que el extracto acuoso de Eryngium heterophyllum Engelm induce efectos significativos sobre la excreción urinaria de agua y electrolitos, lo que apoya las afirmaciones de eficacia diurética y su uso en la Medicina Tradicional mexicana.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Instituto Politécnico Nacional. El trabajo de investigación recibió apoyo parcial de la Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP). JJEB obtuvo la Beca de Estímulo Institucional de Formación de Investigadores (BEIFI) y la beca CONACYT (1008291).

CONFLICTO DE INTERES

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Latin American Journal of Clinical Sciences and Medical Technology, Año 1, No. 1, octubre, 2019 es una publicación contínua editada por Vesalio S.C.; http://www.lajclinsci.com/    Editor responsable: Gilberto Castañeda Hernández.    Reserva de Derechos al Uso Exclusivo: 04-2019-062013242000-203; ISSN: 2683-2291; ambos otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor.    Responsable de la última actualización de este número, Web Master Hunahpú Velázquez Martínez, calle San Luis Potosí # 182-1, Col. Roma, Alcaldía Cuauhtémoc, C.P. 06700, Ciudad de México; teléfono: 55 64 40 41    Fecha de última modificación, 30 de marzo de 2020.
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