A medida que creció el interés por lograr uniformidad en el tipo y ejecución de parámetros analíticos para la validación de métodos donde las muestras a analizar son matrices biológicas, la literatura de diferentes organismos regulatorios o no al respecto ha sido variada y extensa.^1-3

Aun cuando hoy en día se tiene un alto grado de uniformidad en la terminología, tipo y metodología de los parámetros aplicados para alcanzar la validación de métodos analíticos en matrices biológicas —que incluso alcanza la armonización del tema entre Estados Unidos de Norteamérica (FDA, Food and Drug Administration)⁴, la Unión Europea (EMA, European Medicines Agency)⁵ y Japón (ICH, International Council for Harmonisation)⁶— el por qué, cuándo, dónde y cómo aplicar las características de desempeño sigue dependiendo del alcance y la literatura consultada.

Demostrar que un método analítico es válido para estudios de biodisponibilidad, bioequivalencia y farmacocinética no sólo es una exigencia previa para contar con interpretación adecuada de los datos que promoverán decisiones clínicas en el tipo de estudios mencionados, también es requisito legal.

Para evitar que en un ámbito local exista discrepancia en cuanto a la interpretación y/o ejecución de los diversos parámetros analíticos —por parte de la autoridad respecto a la información internacional existente y llegue a ser un obstáculo técnico para alcanzar el objetivo deseado—, se emiten normas de cumplimiento obligatorio.

En México, existen varios organismos que proporcionan información útil para llevar a cabo la validación de un método analítico sin el alcance de la aplicación para métodos bioanalíticos, tales como las guías de validación del Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos de México A.C.⁷, manuales de desarrollo analítico (UNAM)⁸ y la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM).⁹

Sin embargo, únicamente la Norma Oficial Mexicana 177-SSA1-2013¹⁰ de cumplimiento obligatorio es el documento oficial vigente que abarca los requisitos mínimos y criterios de aceptación a los cuales deben apegarse los laboratorios, hospitales, centros de investigación, universidades e instituciones que llevan a cabo la validación de métodos analíticos para cuantificar fármacos en matriz biológica.

Este trabajo desglosa parte de la normatividad mexicana que orienta, simplifica y unifica criterios para demostrar que un método analítico es válido para cuantificar fármacos y/o sus metabolitos en una matriz biológica por CLAR (cromatografía líquida de alta resolución), aplicada a estudios de biodisponibilidad, bioequivalencia y/o farmacocinética sin contraponer su propósito a lo dispuesto por la normatividad internacional con un ejemplo específico: la validación de un método analítico para la cuantificación de lamotrigina en plasma humano desarrollado en un laboratorio de investigación farmacológica con fines de monitoreo clínico.

Al final se concluye que las características de desempeño de la NOM-177-SSA-2013, aplicadas a la validación del método desarrollado, evidencian la validez y aplicación de éste para los fines establecidos.

Reactivos

Para cuantificar lamotrigina en plasma humano se utilizó lamotrigina estándar secundario farmacéutico (Sigma-Aldrich) y como estándar interno metilparabeno (Supelco).

Para la preparación de la fase móvil se utilizaron acetonitrilo (Honeywell) y metanol (BDH) grado cromatográfico, así como fosfato monobásico de potasio (J.T. Baker).

El agua desionizada de alta pureza se obtuvo internamente mediante un equipo Milli-Q Regent Water System.

La fase móvil y disolventes para emplear en el sistema cromatográfico se filtraron a través de membrana de nylon (47 mm, tamaño de poro 0.45 μm, Sigma-Aldrich).

Preparación de soluciones

Fase móvil

Fue preparada con una mezcla de solución de fosfatos 0.03 M, pH 4.5, acetonitrilo y metanol en una proporción 70:20:10 v/v/v, respectivamente.

Se pesaron 0.005 g de lamotrigina estándar y se disolvieron con 20 mL de acetonitrilo en un matraz volumétrico de 50 mL. Una vez que se disolvió mediante un proceso de sonicación, se llevó a volumen con acetonitrilo.

De la solución stock A de lamotrigina se transfirieron 5 mL a un matraz volumétrico de 50 mL, y se llevó a volumen con acetonitrilo.

Se pesaron 0.01 g de metilparabeno y se disolvieron con 20 mL de metanol en un matraz volumétrico de 50 mL, para posteriormente llevar a aforo con el mismo disolvente.

Preparación de curva de calibración y puntos control

Para construir la curva de calibración en seis niveles de concentración por triplicado y los puntos control en cuatro niveles de concentración —muestra control baja, muestra control media, muestra control alta y límite de cuantificación— se adicionaron a 100 µL de plasma libre de fármacos, 50 µL de solución de estándar interno, diferentes volúmenes de solución A o B de lamotrigina según corresponda para alcanzar la concentración deseada en cada punto. El volumen final fue de 1000 µL con metanol.

Todas las muestras se agitaron mecánicamente por 100 segundos y se centrifugaron a 13,400 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido se transfirió a un vial y se leyó en el cromatógrafo utilizado, en este caso un HITACHI^® Elite LaChrom acoplado a un detector UV-visible y una columna Symetry C18 150X4.6 mm, tamaño de partícula 5 µm.

Preparación de muestras

Se adicionaron a cada 100 µL de muestra plasmática, 50 µL de solución de estándar interno y 850 µL de metanol. Se agitó mecánicamente por 100 segundos y se centrifugó a 13,400 rpm durante 10 minutos. De esta forma se realizó una extracción líquido-líquido con precipitación de proteínas para liberar el fármaco de la matriz biológica. El sobrenadante se transfirió a un vial y se leyó en el cromatógrafo con las condiciones mencionadas en la preparación de la curva de calibración.

Previo a la validación del método, se debe elaborar un protocolo que incluya la descripción detallada, objetivo, definición y descripción de los parámetros analíticos (características de desempeño) que conformarán la validación de acuerdo con el propósito que se pretenda.¹⁰ Asimismo, se deben redactar los criterios y procedimientos para realizarlos, sea el caso de metodologías desarrolladas o metodologías comerciales.

Acorde con la normatividad mexicana, los métodos diseñados específicamente para la determinación cuantitativa de un fármaco o biomolécula en muestras biológicas, aplicados ya sea a pruebas de intercambiabilidad (bioequivalencia) o biodisponibilidad en humanos, deben, además, contar con procedimientos normalizados de operación que aseguren la correcta separación (pre proceso), manejo, traslado, identificación, almacén y disposición final de las muestras involucradas en el método.¹⁰

El avance tecnológico tanto instrumental como en el procesamiento y/o preparación de diversas muestras biológicas para medir concentraciones de un fármaco con límites de detección cada vez más reducidos hace que la técnica CLAR sea una de las herramientas preferidas en el desarrollo y validación de métodos analíticos para cuantificar fármacos.^11,12

La CLAR requiere de muestras pequeñas y se pueden medir varios fármacos en la misma corrida.¹¹ Esencialmente, es un proceso físico donde las moléculas de una mezcla se dispersan por distribución en dos fases: una estacionaria (columna) y la otra móvil (fase móvil).

El proceso se genera a partir de la adsorción y desorción de los componentes de la muestra con el lecho estacionario y su afinidad con la fase móvil¹³, pero dependen de la combinación de diversas condiciones cromatográficas involucradas como el equipo cromatográfico, tipo de columna, composición de la fase móvil, temperatura del horno, flujo de la bomba, tipo de detector, volumen de inyección y, dependiendo de la metodología, estándar interno.

En la tabla 1 se encuentran, a modo de ejemplo, las condiciones finales utilizadas para cuantificar lamotrigina en plasma humano con un método de CLAR fase reversa desarrollado en nuestro laboratorio.

En concordancia con la literatura internacional, la normatividad mexicana también establece que sólo se procederá a la validación del método una vez que se cuente con las condiciones cromatográficas necesarias para la cuantificación del fármaco en la matriz biológica.

Se establece como mínimo la determinación de^4-6,10:

• selectividad,
• curva de calibración,
• límite inferior de cuantificación,
• repetibilidad y reproducibilidad (en términos de precisión y exactitud),
• estabilidad a corto y/o largo plazo,
• cualquier requerimiento extra según la metodología y el objetivo del protocolo.

Los parámetros analíticos (características de desempeño) fueron contemplados en este estudio.

Selectividad

Es el parámetro cuyo objetivo es demostrar que las moléculas endógenas y exógenas asociadas a la matriz biológica no interfieren entre sí en la señal cromatográfica. Se determina mediante la evaluación individual de al menos 6 diferentes unidades de ésta.¹⁰

La selectividad para este ejemplo se evalúo tal como lo marca la normatividad mexicana¹⁰: ejecutando el blanco (matriz biológica sin analito de interés ni estándar interno); donde se encontró

• la señal típica del frente del disolvente y el control cero (matriz biológica con estándar interno y sin analito);
• la señal típica del frente del disolvente y un pico representativo del estándar interno.

Adicionalmente, se requiere establecer una adecuada resolución (Rs > 1.5) entre los picos obtenidos (que no deben sobreponerse), por lo que se analizó una muestra que contiene ambos (analito y estándar interno) a una concentración de 5 μg/mL y 10μg/mL, respectivamente. El cálculo de la resolución se efectúo con la siguiente operación matemática:

Rs=(t2-t1)/((1/2)(w1+w2))

En esta expresión matemática (t) se refiere al tiempo de retención y (w) a la anchura del pico. En la gráfica 1 se observa el ejemplo de la corrida analítica de lamotrigina y su estándar interno, donde se demuestra que no existe sobreposición entre ellos. El resultado es una resolución mayor a 1.5 entre los picos.

Es importante mencionar que, en el ejemplo descrito, al tratarse de un método con finalidad de monitoreo farmacológico, la evaluación de la selectividad contempló también la evaluación de la no interferencia de posibles fármacos de uso concomitante (topiramato, levetiracetam, oxcarbazepina, paracetamol, naproxeno y diclofenaco) con la respuesta de nuestro fármaco de interés (lamotrigina).^13,14

Señales cromatográficas para oxcarbazepina, paracetamol y levetiracetam fueron detectadas con el método propuesto en los 4.2 minutos, 1.65 minutos y 1.15 minutos, respectivamente. Ninguna de ellas interfirió con la señal de lamotrigina. El resto de fármacos evaluados (topiramato, naproxeno y diclofenaco) no mostró señal alguna empleando el método señalado. Por lo tanto, el método es capaz de diferenciar el analito de interés en la matriz biológica de agentes endógenos y exógenos.

Curva de calibración

Se establece conforme a la aplicación cuantitativa que pretenda cada método en específico, es decir, en función de las concentraciones esperadas del analito de interés.

Para este ejemplo, las concentraciones de lamotrigina se eligieron conforme al intervalo terapéutico reportado entre 3 y 14 µg/mL del fármaco.^13,14 En la gráfica 2 se observa que, para el ejemplo de la lamotrigina, existe una relación lineal continua y reproducible del tipo: y=mx+b, que se describe entre el rango de concentraciones establecido para el método (0.3 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL y 50 μg/mL) y la señal cromatográfica (relación de áreas bajo la curva).

Dentro de este intervalo, el porcentaje de desviación para las concentraciones recuperadas sobre el del valor nominal fue menor al 15% en cada nivel, incluido el límite inferior de cuantificación. Lo anterior cumple satisfactoriamente lo establecido por la normatividad respecto a la curva de calibración, la cual indica que se debe demostrar relación entre la concentración nominal del analito de interés y la respuesta del método en un intervalo de trabajo de seis concentraciones diferentes en función de las respuestas esperadas durante el análisis de las muestras problema.

Las concentraciones no deben incluir la muestra blanco y debe realizarse por triplicado en la misma matriz biológica que las muestras a analizar.¹⁰ La curva de calibración es válida si la relación entre la concentración y la respuesta es continua y reproducible en el intervalo de trabajo y si el porcentaje de desviación para la concentración recuperada sobre el del valor nominal es menor al 15% en cada punto, excepto para el límite inferior de cuantificación, en cuyo caso se acepta hasta un 20%.¹⁰

Límite inferior de cuantificación (LIC)

Se debe determinar con base en el 5% de la concentración máxima (C_máx), reportada para el analito de interés, a menos que los objetivos del estudio especifiquen algo diferente, por ejemplo, un muestreo truncado, distribución rápida o alta variabilidad farmacocinética.¹⁰

Para que el límite inferior de cuantificación sea validado, se debe llevar a cabo la evaluación por quintuplicado de la concentración nominal más baja y al obtener las concentraciones recuperadas, éstas deben encontrarse dentro del +/-20% de desviación promedio para la exactitud y no exceder el 20% de coeficiente de variación para la precisión.

El LIC definido para la cuantificación de lamotrigina en plasma humano en el ejemplo presentado fue de 0.3 μg/mL, y como puede observarse en la tabla 2, se encuentra dentro de los parámetros establecidos en la normatividad, lo cual indica que la mínima concentración de lamotrigina en la curva propuesta puede ser cuantitativamente determinada con exactitud y precisión aceptables.

Precisión

Se refiere a la concordancia entre resultados individuales al aplicar repetidamente un procedimiento analítico experimental. Este parámetro es referido tanto en literaturas internacionales como en la normatividad mexicana, valorada en términos de repetibilidad y reproducibilidad.^4-6,10

En las tablas 3 y 4 se presentan resultados para la cuantificación de lamotrigina, obtenidos al aplicar lo establecido en la normatividad para los parámetros de precisión en términos de repetibilidad y reproducibilidad, respectivamente. Puede observase que el método es preciso de acuerdo con los criterios de aceptación vigentes.

La repetibilidad valora la precisión en semejantes condiciones de operación.

Analizando por quintuplicado en un mismo día, los puntos control bajo, medio y alto, además del LIC, cuyos valores nominales deben empatar con el intervalo de trabajo de la curva validada.

La concentración para cada nivel por interpolación de su respuesta analítica en la curva debe mantener un coeficiente de variación (%CV) ≤ 15% en todos los puntos analizados, excepto para el LIC, el cual permite hasta 20%.¹⁰

En tanto, la reproducibilidad (llamada de intralaboratorio por la normatividad mexicana) toma en cuenta la precisión bajo diferentes condiciones que pueden cambiar en el sitio de aplicación: días diferentes, cambio de analista, modificación o cambio de equipos, entre otros.

Los requisitos normativos destacan la valoración de la reproducibilidad del método para diferentes días al aplicar:

• un análisis al menos por quintuplicado similar al de la precisión, con la diferencia de ejecutarlo en tres corridas analíticas diferentes y en al menos dos días,
• el cumplimiento de criterios de aceptación de forma similar que en la repetibilidad del método.¹⁰

Exactitud

La gran mayoría de las guías para validación de métodos bioanalíticos por CLAR para la cuantificación de analitos en muestras biológicas describe el desarrollo experimental y criterios de aceptación para el parámetro de exactitud de forma conjunta con los de precisión del método.^4,5

En la normatividad mexicana¹⁰ no es así, los parámetros se encuentran descritos separadamente; no obstante, la evaluación del parámetro de exactitud indica que se deberá llevar a cabo mediante el uso de datos de repetibilidad y reproducibilidad (lo cual hace una diferencia sólo de forma, pero no de concepto) al calcular la desviación de la concentración obtenida respecto al valor nominal (% de desviación) empleando la siguiente ecuación:

% de desviación=(100)((concentración adicionada-concentración obtenida)/(concentración adicionada))

Los resultados generados para la exactitud del método intra día o en días diferentes para los cuatro puntos control ensayados se presentan en las tabla 3 y 4. De acuerdo con los resultados obtenidos para este parámetro, se puede indicar que el método se considera exacto, ya que el valor promedio del porcentaje de desviación no fue mayor al 15% en ningún punto control analizado, incluido el límite inferior de cuantificación, el cual puede tener un porcentaje de desviación menor o igual a 20%.¹⁰

Estabilidad

Este parámetro es crucial en la validación, ya que el análisis cuantitativo del fármaco en la muestra biológica no se realiza inmediatamente después de su recolección. Generalmente, las muestras primero se someten a un proceso de separación y el sobrenadante de interés se resguarda para su posterior análisis según el procedimiento establecido.¹⁵

Las condiciones para que un analito se mantenga estable dentro de la matriz a analizar depende del manejo, proceso y, sobre todo, del almacenaje acorde con la metodología propuesta. Por ello, las condiciones de almacenamiento deben cubrir todas las situaciones relevantes a las que se enfrentará la muestra en la práctica.

La normatividad mexicana no difiere de la literatura internacional al referir que la estabilidad debe evaluarse por triplicado del análisis del punto control bajo y alto una vez que se preparan y se someten a las diferentes condiciones propuestas, según sea el caso e indicación del protocolo:

• a corto o largo plazo,
• muestra procesada,
• estabilidad en el automuestreador,
• ciclos de congelación-descongelación, entre otros.

Incluso se marca la evaluación de la demostración de la estabilidad de la solución de referencia principal en caso de no utilizarla de forma inmediata.

Se compara la desviación promedio de las concentraciones obtenidas posterior a cada condición de estabilidad contra la concentración nominal inicial, que no debe exceder el +/-15% CV, respecto a la concentración nominal para ser consideradas confiables.¹⁰ Para ejemplificar este punto se construyeron las tablas 5 y 6, en las que se presentan los resultados del reto de estabilidad en la cuantificación de lamotrigina en plasma humano tras el resguardo en refrigeración (5+/- 3 °C) de las muestras a corto plazo (1, 2 y 3 días) y a largo plazo (15 y 90 días), respectivamente.

Como se puede observar, el punto control bajo (0.4 μg/mL) y del punto control alto (30 μg/mL) se encuentran dentro del 15% CV permitido. Ello significa que las muestras son estables en condiciones de refrigeración al menos durante 90 días de almacenamiento.

Para el campo biofarmacéutico, desarrollar metodologías que puedan cuantificar fármacos en matriz biológica por medio de técnicas cromatográficas abarca varios ámbitos. Obtener información acerca de la biodisponibilidad de los fármacos de interés es uno de ellos.^16-18

Algunos estudios de intercambiabilidad comparan la biodisponibilidad de un medicamento de prueba contra uno de referencia; si no hay diferencia estadística entre ellos se dice que los medicamentos son bioequivalentes.^18,19

Para ensayos clínicos, vigilar los niveles de concentración de un fármaco en el organismo permite establecer regímenes de dosificación adecuados.^20,21 También, emplear métodos analíticos para cuantificar fármacos de ventana terapéutica estrecha tiene como finalidad comprobar que la dosis administrada sea la asociada a seguridad y eficacia, es decir, la llamada monitorización de fármacos.^20,21

Cualquiera que sea el objetivo del método validado, la última fase de la validación es su aplicación al análisis real de las muestras. Para el ejemplo que compete en este escrito, se realizó la cuantificación del fármaco en muestras plasmáticas provenientes de pacientes a los cuales se les administró lamotrigina vía oral con la finalidad de evidenciar la aplicación del método en el monitoreo de los niveles séricos del fármaco.

En la gráfica 3 se presentan cursos temporales de concentración plasmática de lamotrigina en función del tiempo que evidencia satisfactoriamente la aplicación de la metodología validada para cuantificar la sustancia de interés en plasma por medio de la técnica CLAR, acorde con los requisitos de la NOM-177-SSA1-2013 (modificación reciente).²² Los resultados sugieren que los niveles plasmáticos de lamotrigina en los pacientes se encuentran en el intervalo terapéutico señalado en la bibliografía.^13,14